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1、苏云金杆菌杀钻心虫吗?杀。
苏云金杆菌是一种包括许多变种的产晶体芽孢杆菌,该菌能够产生毒素,杀死害虫,具有杀虫谱广,无抗药性等特点。防治玉米螟、甘蔗二点螟、水稻二化螟...
2、苏云金杆菌杀虫卵吗?
防治鳞翅目害虫幼虫一般在害虫卵孵化盛期前及时用,防治效果最佳。
3、苏云金杆菌能杀死蜗牛吗?
可以。苏云金杆菌是一种选择性很强的神经毒剂类杀虫剂,主要用于防治蜗牛、蛞蝓等软体害虫,以触杀和胃毒作用为主,其触杀作用比胃毒作用更强。
当蜗牛接触到药剂后,能使螺体内乙酰胆碱酯酶大量释放,破坏螺体内特殊的黏液,使螺体迅速脱水,神经麻痹,并分泌大量黏液,害虫大量**的流失和细胞被破坏、导致螺体、蛞蝓等软体害虫在短时间内中毒死亡,对人,牲畜低毒,对鱼类、蚕等环境生物毒性低。
4、苏云金杆菌杀跳蚤吗?能。
苏云金杆菌,简称Bt,该菌可产生两大类毒素,即内毒素(伴胞晶体)和外毒素,使害虫停止取食,后害虫因饥饿和中毒死亡。因此该杆菌可做微生物源低毒杀虫剂,用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目,特别是鳞翅目的多种害虫。
广泛应用于十字花科蔬菜、茄果类蔬菜、瓜类蔬菜、烟草、水稻、高粱、大豆、花生、甘薯、棉花、茶树、苹果、梨、桃、枣、柑橘、棘等多种植物;主要用于防治鳞翅目害虫,如菜青虫、小菜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、甘蓝夜蛾、烟青虫、玉米螟、稻纵卷叶螟、二化螟、松毛虫、茶毛虫、茶尺蠖、玉米粘虫、豆荚螟、银纹夜蛾等多种害虫。部分亚种或菌株对蔬菜根结线虫、蚊幼虫孑孓、韭蛆等害虫也有防治作用。
5、苏云金杆菌可以浇水冲施吗?不能冲施。
苏云金杆菌用法用量,以及注意事项:
1、使用方法
(1)每亩地使用50g的100亿孢子/g的苏云金杆菌菌粉兑水稀释2000倍,或者是每亩地使用100-200g的苏云金杆菌乳剂与3.5-5kg的细沙混合,撒入草坪,防治草坪害虫。
(2)每亩地使用150-200g的苏云金杆菌可湿性粉剂与3-5kg的细沙混合,撒到作物的心叶内,防治玉米螟。
(3)每亩地使用100-150g的苏云金杆菌可湿性粉剂兑水50kg喷雾,防治菜青虫、小菜蛾、甜菜夜蛾、烟草、烟青虫。
(4)每亩地使用100-200g的苏云金杆菌可湿性粉剂兑水50-70kg稀释喷雾,防治棉花、棉铃虫、造桥虫、水稻、稻纵卷叶螟、螟虫。
1 苏云金芽孢杆菌类群及致病机理
苏云金芽孢杆菌是一种卓有成效的微生物杀虫剂,在微生物防治害虫的实践中占有极其重要的地位,已被大规模地用于生产,并广泛应用于防治农林害虫、仓库储藏害虫和卫生害虫。
1.1 苏云金芽孢杆菌类群
苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性、产生伴晶体、能寄生于昆虫体并引起虫体发病的芽孢杆菌。按其菌体抗体原(H抗原)分类,目前已发现的苏云金杆菌有45个血清型(其中10个含H因子)。我国分离的苏云金杆菌血清型有H1、H2、H5a5b、H5a5c、H6、H7、H8a8c、H9、H10、H14、H18、H20、H22、H40、H42和H43。
苏云金芽孢杆菌类群是包括许多亚种。**的石渡(Ishiwata)第一次从桑蚕中分离出此类细菌的一个亚种,曾被命名为猝倒芽孢杆菌(Bacillus sotto),随后在1911年德国动物病理学家Barliner从德国苏云金地方的地中海粉螟(Anagasta kuhniella)中又分离出一株致病细菌,1915年首次定名为苏云金芽孢杆菌(Bacillas thuringiensis)。此后世界各国又先后从蜡螟(Galleria)、家蚕、西伯利亚松毛虫(Dendrolimus sibiricus)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、一点谷螟(Aphomia galaris)、红铃虫(Pectinophora gossypiella)及其它鳞翅目幼虫中分离出与苏云金芽孢杆菌类似的产晶芽孢杆菌,被陆续命名为苏云金芽孢杆菌的各个亚种。
1. 苏云金芽孢杆菌的培养及其生物性
苏云金芽孢杆菌在蛋白胨—琼脂培养基中,30℃培养24小时,形成针尖大小的**小点,边缘光滑,显微镜下观察,深色菌落成毡状放射线;72小时为圆盘状,直径约1cm,菌落淡**而湿润,边缘不整齐,成粗布状向外展开,略呈放射状皱纹。
研究表明,苏云金杆菌对营养条件要求不高,能在多种氮源、碳源和无机盐组成的培养基中生长增殖。在生长期间,菌体在葡萄糖和盐类的培养基上生长缓慢,并很少生成芽孢。氨基酸对苏云金杆菌的生长起着重要作用,一般来说,多数菌株只需要一种氨基酸作为外源性氨基酸来完成细胞生长及芽孢、晶体的合成,其中天冬氨酸、谷氨酸以及精氨酸是维持苏云金杆菌生长发育的重要氨基酸,苏氨酸、色氨酸和丙氨酸能使少数菌株微弱生长,而丝氨酸则对菌的生长有抑制作用。
培养基中糖、氮源和磷源的含量比例对苏云金杆菌的生长有显著影响,其中以氮源对菌体细胞数量影响最大,而后依次为糖源和磷源,培养基氮源含量由0.1%增至0.8%,菌数显著增加,但如糖含量增至1.5%,菌数反而下降。发酵周期的长短,主要取决于培养基中含糖和磷酸盐水平的高低,含糖少(0.1%),周期短;含糖多(1.5%),周期长。
2. 苏云金芽孢杆菌类群的分类和鉴定
苏云金芽孢杆菌在1915年首次以 Bacillus thuringiensis Berliner新种出现于文献,其后原始菌种失传,Mattes于1927年重新从地中海粉螟中分离出相同菌种,即为苏云金芽孢杆菌Mattes品系。当时,它的学名及分类地位都是很明确的。但随着苏云金芽孢杆菌的新亚种和新菌株逐渐被分离和发现,而且也由于芽孢杆菌属的种类无论在形态特征以至生化反应上都很近似,因而苏云金芽孢杆菌的学名和分类地位曾出现过较长时间的分歧。1958年,Heimpel和Angus以某些形态学和生化特性为基础研究了7个产生晶体的菌株,并将它们区分为3个亚种。即苏云金芽孢杆菌苏云金亚种(B.thuringiensis subsp. Thuringiensis Berlier)、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种(B.thuringiensis sotto Ishiwata)和苏云金芽抱杆菌阿莱亚种(B.thuringiensis subsp. alesti);以后de Barjac和Bonnefoi(1962)幼对24个产晶体的菌株进行了生化和血清学的研究,将所有这些产晶体的菌株都作为一个类群——苏云金芽孢杆菌类群,并按血清型将各菌株分列为6个血清型的8个亚种,如果某些生化特性不同,还可区分为不同的生物型。至1964年,Norris发现不同亚种的酯酶电泳具有特定的图型,证明用脂酶型来区分晶体细菌与用血清学来区分的结果是一致的,因此认为用酯酶分析可作为辅助的分类标准。随着新亚种的不断出现, de Barjac和Bonnefoi于1973年采用上述标准将分属于12个血清型的17个亚种制成了检索表。从此苏云金芽孢杆菌是一个含有较多亚种的独立种,已为大多数科学家所接受。
鉴别苏云金芽孢杆菌的亚种,可以采用形态、培养特征、生理生化反应、鞭毛抗原血清(H抗原)的特性和酯酶分析等指标,但由于形态和培养特征在各亚种之间的差别很少,因此不能作为亚种鉴定的主要依据。所以,目前分类的标准主要是依据生化反应、H抗原和酯酶分析。生化反应是利用亚种之间生理生化上的差异,如碳源、氮源的利用和某些酶类或代谢产物的有无等,可以把它们区分开来。生化反应虽有简便易行的优点,但在亲缘关系较近的亚种之间,由于它们仅有极小的差别,往往会导致错误的 。 苏云金芽孢杆菌不同亚种的鞭毛具有特异抗原性, 采用鞭毛抗原血清分析的血清学反应就有较高的鉴别能力,它能进一步分出生化反应未能区分的亚种。但是在鉴定未知亚种时,必须用标准菌株对照做H抗原分析,初步确定血清型;然后再以生化反应加以验证,就可较快地确定亚种的分类地位。
除了用生化和血清反应外,也可以采用酯酶电泳图型作为分类标准进行鉴别。由于酯酶电泳具有较高的特异性,条件要求较严格,因此必须有酯酶型菌种作为对照。
3. 苏云金芽孢杆菌类的有效菌株
苏云金杆芽孢菌类对害虫的毒效,不仅各个亚种之间有很大差异,而且在同一亚种的不同菌株也有明显区别。即使是同一菌株,随害虫不同,其毒效也很不一致。 在苏云金芽孢杆菌制剂的生产中,选育高毒力的有效菌株或具有其它特异性的菌株就有重要的实际意义。
湖南省微生物研究所采用家蚕蚁蚕的生物测定法,以美国HD-l菌株为对照,比较了不同亚种以及同一亚种下同菌株的苏云金芽孢杆菌的毒效,说明在参加比较的十几个亚种和菌株中,以血清5型的青虫菌(蜡螟亚种)和3型的天门亚种毒效最强,武汉亚种(140)次之。
**学者鲇泽启夫曾用紫外线等复合处理,选育到一株属猝倒亚种的菌株(AF101),对家蚕低毒,对白粉蝶、小菜蛾和美国白蛾则具有高毒;他选育的另一株鲇泽亚种的菌株AY,对莲纹夜蛾(Spodoptera litura)有很强毒性,而莲纹夜蛾是对苏云金芽孢杆菌类群抗性较强的害虫。他以美国HD-1标准品为对照,比较了AF101和AY的菌剂对家蚕、美国白蛾和莲纹夜蛾的毒性(表7-1)。说明苏云金芽孢杆菌类不仅对害虫的毒性很明显,而且同一菌株随着作用对象不同其毒效有很大差异。
在苏云金芽孢杆菌生产菌株的选择上,必须针对不同的防治对象,选育不同的亚种或同一亚种的不同菌株作为有效菌株进行生产,使制成的商品菌剂可以专门防治一种或几种近缘的害虫,这样对提高微生物防治的效果是有根大价值的。
1.2 苏云金芽孢杆菌类群的致病机理
表7-1 苏云金芽孢杆菌制剂对不同害虫的毒效
制剂名称 制备制剂的
亚 种
芽孢数/g IU/mg(毒效的国际单位)
家 蚕 美国白蛾 莲纹夜蛾
美国标准品
(HD-1-S-1971)
AY制剂
AFl01制剂 摩斯塔克杆菌
鲇泽杆菌
猝倒杆菌 3.00×1010
2.08×1010
2.63×1010
95 1800
6800
无毒性
1. 苏云金芽孢杆菌的毒素
苏云金杆菌能产生多种对昆虫有致病力或毒杀作用的毒素,主要有:
(1)α-外毒素 又称卵磷酯酶或磷酸酯酶C,是一种对昆虫肠道有破坏作用的酶。
(2)β-外毒素 即苏云金素,又称热稳定外毒素,耐热毒素。由于这种毒素对家蝇有特异性的致病作用,故也称**素。由Me Connel等于1959年首次发现,具有热稳定性质,经 120℃15分钟不失活,能溶于水,可透析,是一种核苷酸类物质。在菌体生长过程中先于芽孢和晶体产生,通常在培养24小时达到最高量。一般在1L培养液中可产生50mgβ-外毒素。采用适宜的剂量将这种毒素注入虫体或经口服对某些昆虫有毒效。
β-外毒素的成分和结构的研究证明,它是一种腺嘌呤核苷酸物质,与5′-AMP(5′-腺苷-磷酸)相似,其成分为1:1:1的腺嘌呤:核糖:磷酸盐。分子量在700~800之间(de Barjac等1965,1968),进一步的研究(Kim等,1970,1972)还表明,该毒素包含有两种核苷酸衍生物,即苏云金素A和苏云金素B,两者都含有一个腺嘌呤、一个核糖、一个磷酸、一个葡萄糖和一个未鉴定的多羟基羧酸残基,羟基在A是游离的,在B则结合为γ-内酯。实际上,A可加热失水而成B,B则可由碱水解而成A。无水的苏云金素A分子量是701,含水的则为755。对家**力,A大于B约8倍。
β-外毒素的杀虫范围比晶体毒素要广,并不局限于鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫,对膜翅目、直翅目等多种昆虫也都有不同程度的活性。但β-外毒素并不是苏云金芽孢杆菌类群的所有亚种和菌株都能产生的。据报道,血清1型的各菌株(除捷克058菌株外)都能产生β-外毒素,血清型4a4b,4a4c,5,8,9,10,11及12中的某些菌株也能产生此毒素;血清型3a,3a3b,7及14不产生。我国报道的武汉亚种、天门亚种、玉米螟亚种及云南亚种也不产生β-外毒素。 β-外毒素的产生也受培养方法、培养基成分、培养时间和酸碱度等因素的影响。
(3)δ-内毒素 又称晶体毒素。它是一种毒原(protoxin)或称前毒素,须经敏感昆虫肠道蛋白酶消化后,或在碱性条件下由蛋白酶消化或酶解才释放出对昆虫有毒力的较小分子量的毒蛋白。
在光学显微境下,晶体多为菱形,但不同菌株或同一菌株由于培养条件不同也会产生其它形状的晶体,如近于圆形、四方形或不规则形等;据Evlakhove和Shvetsova(1963)证明晶体形状和大小的差别,可证明在对昆虫毒力上的差异。
晶体的长度一般为l~2µm,宽度约为0.5µm。在电子显微镜下,晶体是一个规则的双锥形,呈八面体,表面可以看到有隆起和下陷部分所形成的平行条纹,条纹间的距离为29nm。这种特殊构造主要是由于组成晶体的蛋白质亚单位可能是短杆状或哑铃形的,大小约为5.0×15.5nm。
晶体不溶于水和有机溶剂,如氯仿、丙酮、**、木醇等,但溶于碱性溶液,可被2%的硫酸铵沉淀而不失去毒力。在pH3.3以下和pH12以上,或用一般使蛋白质变性的物质处理(如甲醛、三氯醋酸、氯化亚汞等),则晶体的毒性受到破坏而失去活性。高温也能引起晶体毒素变性,如在100℃下30分钟即可失活。
晶体蛋白质由18种氨基酸组成,一般谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸及精氨酸最多,蛋氨酸、胱氨酸及色氨酸最少,没有含磷物质。不同变种的晶体氨基酸的组成从种类来说是相同的,各自的含量也相近。这说明它们对于不同昆虫所表现出的不同毒力可能存在于高一级的结构单位之中。
对晶体毒素敏感的昆虫主要有鳞翅目、双翅目和鞘翅目的幼虫,但并不是所有的晶体对这三目中的所有种都有毒效。大多数亚种产生的晶体对鳞翅目的许多幼虫有高毒性,以色列亚种的晶体只对双翅目的蚊和蚋幼虫有剧毒,拟步行甲亚种则只对鞘翅目幼虫有毒,两者的晶体对鳞翅目幼虫都无毒。还有少数亚种的晶体毒素对昆虫只有极低的毒性或无毒。
(4)γ-外毒素 这是一种或几种未经鉴定的酶,能使卵黄琼脂澄清。
在所有这些毒素中,研究得较多的,同时也是杀虫中起重要作用的是δ-内毒素,其次为β-外毒素。
2. 苏云金芽孢杆菌毒素的致病机理
(1)δ-内毒素的致病机理 δ-内毒素对昆虫的毒害主要是胃肠毒作用, 必须由敏感昆虫吞食苏云金芽孢杆菌的δ-内毒素和芽孢后才能生效。它们感染的主要途径是:从**经食道、嗉囊而至中肠;破坏中肠后,细菌侵入体腔,使**PH发生变化;菌体进一步繁殖后就引起幼虫败血症及全身瘫痪而致死亡。
δ-内毒素对昆虫的致病机理以对鳞翅目幼虫研究最多。对δ-内毒素敏感的不同鳞翅目幼虫食入δ-内毒素后的致病反应是不相同的。Heimpel(1963)将这些反应归纳为4个类型。第一种类型的幼虫吞食晶体后突然停止取食,约20~30分钟中肠麻痹,l~7小时内肠壁破损,肠内碱性物质渗入体腔,引起**PH值增高,肠道整个透性失调,特别是钾离子的控制失灵,导致全身瘫痪而死亡。这是晶体造成的典型症状。属于这个类型的昆虫有家蚕、柞蚕和烟草天蛾等。第二种类型的幼虫吞食晶体后也引起中肠麻痹,但肠道内含物不渗入体腔,因而**的pH值基本不变,也无全身瘫痪症状,随晶体而被食入的芽孢萌发增殖,产生的有毒代谢物质加速幼虫的崩溃,通常经2~4天死亡。大多数的鳞翅目幼虫属于这个类型。第三种类型的幼虫需要晶体和芽孢同时吞食后才大量中毒死亡,若单独晶体或芽孢则死亡率很低,例如,地中海粉螟幼虫的死亡率分别为12%~13%和4%~8%,而同时吞食晶体和芽孢的死亡率则为80%~92%,此类病症不表现全身瘫痪,而是缓慢中毒或伴随下痢,经2~4天死亡。这个类型的幼虫是地中海粉螟及舞毒蛾等。第四种类型的幼虫对δ-内毒素不敏感,例如甘蓝夜蛾、小地老虎和黄地老虎等。
关于δ-内毒素的致病机理虽然有相当多的报道,但涉及面较为复杂,有些问题尚待深入研究。
3. β-外毒素的致病机理 β-外毒素的毒效比δ-内毒素要低,而且它的作用仅在昆虫脱皮或**时可以明显看到,这种毒素可杀死多种昆虫的幼虫或使幼虫发育不正常,虫体某些部分残缺不全等。例如,家蝇3龄幼虫对这种毒素非常敏感,感染3天后可引起幼虫脱皮时死亡或造成独特的致病症状,使幼虫发育受到明显的影响,如出现半化蛹(上部是幼虫,下部是蛹)、畸形蛹、不羽化蛹,以及形成畸形的成虫,包括残缺翅、窄而光的腹部、上唇萎缩等现象。
昆虫在脱皮或**时是RNA合成的高峰期,能被外毒素干扰。研究指出,外毒素可抑制 RNA聚合酶的作用,与ATP相互竞争。根据外毒素对RNA、DNA及蛋白质合成影响的试验,发现致死剂量的1/3能抑制60%的6-14C乳清酸参入RNA,14C胞核嘧啶核苷的参入也受影响。提纯的外毒素可明显抑制小白鼠体内RNA的合成。外毒素的作用部位可能在三磷酸胞核嘧啶核苷与RNA之间。聚合酶系统受影响的论断已在对大肠杆菌的试验中得到证实,外毒素能抑制依赖于DNA的RNA聚合酶。
2 苏云金芽孢杆菌生产
苏云金芽孢杆菌类杀虫剂的生产方法主要有液体深层发酵和半固体发酵两类。工业生产采用液体深层发酵,其优点是生产量大,产品质量较稳定,生产率高。半固体发酵是采用我国沿用已久的制曲法,利用麦麸、米糠、豆饼等农副产品和水等调制成的半固体培养基,在浅盘上发酵,此法的优点是设备简单,不要求绝对无菌,而且技术较易掌握,可因地制宜生产使用。但缺点是发酵过程的各个阶段不易控制,产品质量不很稳定,劳动生产率低,产量有一定限制。下面主要介绍工业化生产的液体深层发酵生产工艺。
2.1 液体深层发酵
苏云金芽孢杆菌类生产工艺及培养基配方虽不同,但生产过程基本上是相似的,现将我国目前生产的工艺方法大致概要如下。
1. 生产工艺流程 我国苏云金
芽孢杆菌杀虫剂的工业化生产已有
30多年的历史。不同地区、不同工
厂在长期的生产实践中已形成了
各自的特色,但基本工艺是相似的。
生产工艺流程如图7-2所示。
2. 工艺条件
(1)砂土管菌种 为保持菌种优良
性能,避免传代过多而引起退化,生产
的原菌种常以休眠状态的芽孢保存在干
燥而缺乏营养的砂土管中。
(2)茄瓶斜面菌种 将砂土管内的
菌种移接到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的
的茄瓶斜面上,在28―30℃中培养2~3
天,使芽孢从休眠状态活化,并取得制
备种子用的菌体。
茄瓶斜面菌种必须保证纯度,表面长满灰白色丰满的菌苔,无噬菌斑,也无杂菌,经涂片镜检,有95%以上菌体的芽孢和晶体已脱落,且形态正常,合格者可作为菌种,置冰箱保存备用,最好不超过7天。
(3)种子罐培养 是为扩大生产繁殖足够数量而同步生长的纯度种子。
培养基配方:黄豆饼粉 1.0%,糊精 0.4%,蛋白胨0.2%,K2HPO4 0.1%,CaCO3 0.4%,MgSO40.03%,(NH4)2SO40.03%,豆油 0.2%,pH(消前)7.0~7.2。在121℃下灭菌30分钟,待罐内培养基冷却至33℃左右即可接种。
接种与培养:在无菌操作条件下,将30ml无菌水加入茄瓶斜面菌种中,制成菌悬液,再把菌悬液转入灭菌的血清瓶。在酒精灯火焰下,以减压接种法将血清瓶中的菌悬液吸入种子罐,然后进行发酵。培养温度控制在30士1℃,罐压0.5kg/cm2,通气量1:1(体积/体积/分),搅拌速度为200转/分。培养2小时后通气量逐渐加大,经6~8小时,营养体生长至对数期,检查无菌即为合格种子。
(4)发酵罐培养 是细菌大量繁殖并形成晶体和芽孢的阶段,种子质量、发酵培养基成分和发酵条件是影响这阶段产量的重要因素。
培养基配方:花生饼粉2.0%,玉米浆0.9%,糊精O.8%,蛋白胨0.1%,CaCO3 0.2%,MgSO4 0.075%,K2HPO4 0.07%,(NH4)2SO4 0.2%,饴糖0.5%,豆油0.2%。pH(消前)7.2~7.4。
培养基成分可根据条件和经验采用不同配方,在我国发酵培养基中总营养物的含量一般均控制在3%~6%,上面的配方就是属于这一类,但目前也有少数单位采用10%以上的总营养物配方。
配制好的培养基在121℃灭菌30分钟并冷至30℃时,将种子罐中培养好的种子液接入发酵罐。接种量为发酵培养基的1%~2%。
发酵条件及管理:培养温度控制在30士1℃,罐压0.3~0.5kg/cm2,通气量1:1(体积/体积/分)。整个发酵过程应定时取样检查,测定糖、氮、磷的含量和pH值,若有过高过低现象,须采取补料等措施加以调整。培养20~22小时,经检查无杂菌,有80%~90%的菌体明显形成芽孢和晶体,其中有10%左右的芽孢和晶体已脱落,即可放出发酵液。
(5)发酵液的后处理 培养好的发酵液,可根据成品剂型采用不同的方法进行处理。例如,成品为粉剂或可湿性粉剂,则发酵液可按其体积加8%~10%的填充剂(轻质碳酸钙),混匀后经板框过滤获得滤饼。滤饼经烘干粉碎即为粉剂;若将滤饼调浆后加入展着剂,通过喷雾干燥成为可湿性粉剂。如果成品为液剂或乳剂则将发酵液经离心或真空减压浓缩后加入乳化剂,即为乳剂;加入一定量的展着剂、粘着剂和防腐剂,就成为液剂。
2.2 生产中的问题
1. 噬菌体的危害 在杀虫细菌生产过程中,噬菌体的侵染是影响产品的主要问题之一。往往使工业生产连续倒罐,有时甚至**停产。在发酵罐中,噬菌体的感染一般在细菌生长对数期表现最为突出,此时会出现pH值上升,温度增高,镜捡有长形菌体,且有畸形状如中部膨大或局部出现缺刻等。2~3小时后,菌数骤降,甚至全部自溶。如将该发酵液与琼脂培养基混匀做成平板,经培养后在细菌菌落上可出现呈透明的圆形或针点状的噬菌斑。
噬菌体的可能来自菌种本身,也可能来自生产环境。通常可采用下列措施来克服生产中噬菌体的污染问题:
(1)纯化菌种 防止菌种携带噬菌体进入种子罐,可反复分离纯化,也可将老熟菌种制成芽孢悬液在80~85℃的水浴中处理15分钟杀死噬菌体,再平板分离,直到菌落无噬菌斑时,才能用作菌种。
(2)加强环境卫生管理 噬菌体需有寄主才能传播,防止细菌污染环境可减少噬菌体的危害,应定期对发酵环境进行消毒,严格控制废弃菌体和倒罐废液,经无菌处理后才能放出。
(3)选育抗噬菌体的菌株 可以从生产菌种中选出抗噬菌体的菌株,也可采用物理和化学的方法诱变选育。选出的抗株其生产性能不应低于原敏感株的水平。 在缺乏适当抗株时,可采用几株不同的生产菌株轮换使用,因噬菌体有一定程度的专一性,可以减少危害。
2. 产品的标准化问题 近年来对苏云金芽孢杆菌类制剂或菌株缺少统一的标准来表示其毒力的高低,不便对不同菌剂或菌株的杀虫效果进行比较分析。就生产单位来说,由于没有测定毒力的统一标准,而仅以菌剂中芽孢数量表示菌剂的质量,是不准确的。加之生产菌株时有变换,生产条件也常有差异,不同批号的产品质量难以保持稳定。给试验研究和防治实践上都带来一些困难,甚至影响进一步的推广应用,是急待解决的问题之一。
3. 提高菌剂质量和降低成本问题 当前苏云金芽孢杆菌类工业生产的工艺水平还不很高,发酵液含菌数有些厂只达20亿/ml,有的菌数虽较高,但毒力较低。生产成本较之常用化学杀虫剂高。这些都能直接影响苏云金芽孢杆菌类的扩大使用。但这类问题是可以逐步解决的。美国在细菌农药的发展过程中也曾遇到过类似的情况,菌剂毒力较低和出售价较高曾成为推广的障碍,但近年来,由于选用毒力更高的菌种,提高了防治效果,随着生产工艺的改进,提高质量的同时又降低了成本,产品的售价是介于多种化学杀虫剂之间,用苏云金芽孢杆菌类制剂防治害虫既能发挥其特点,防治费用也不比化学防治高。我国目前有些工厂由于提高发酵培养基总营养物的水平,其发酵液的含菌数已达100亿/ml以上,同时改进成品剂型,已使菌剂质量明显提高,成本也有所降低,所以这方面的潜力是很大的。
3 苏云金芽孢杆菌在害虫防治上的应用
苏云金芽孢杆菌类制剂是近年来发展最快、应用最广的微生物杀虫剂,此类制剂的杀虫范围有一定的广谱性,较之真菌和病毒制剂发挥作用迅速,有时其速效性甚至不亚于某些化学杀虫剂,对人及高等动物、益虫、植物安全。害虫对制剂的抗性发展很慢,在适宜的条件下有可能在一定虫种的自然种群中保持、蔓延而引起**的流行,从而发挥长期性的防治效果。 世界各国都予以重视。该类制剂产品在不少国家已经商品化,对产品的工业标准化、国际标准化、杀虫效果、病理机制、提高菌效的途径、使用方法的改进等方面都有比较深入广泛的研究。
3.1 在防治农业害虫中的应用
我国应用苏云金芽孢杆菌制剂防治蔬菜、果树、小麦、玉米、棉花、水稻、油料作物、茶树等作物的某些害虫,均取得了显著效果。
利用苏云金芽孢杆菌防治粮食作物害虫,我国北方主要用于防治小麦和玉米害虫,南方主要用于防治水稻害虫。用苏云金芽孢杆菌7216制剂配成5亿/g~8亿/g颗粒剂防治第一代玉米螟,防效可达75%~80%;河北沧州地区用10亿/g的苏云金芽孢杆菌77-1颗粒剂防治玉米螟,蛀茎下降率达86%~93.4%,蛀孔下降率可达93%~93.7%。
在我国南方,应用苏云金芽孢杆菌防治三化螟,单独使用时防治效果一般为40%~70%,添加少量化学农药,其效果则显著提高。湖北、河北、河南、江苏、黑龙江等省用青虫菌(蜡螟亚种)防治玉米螟,其效果比某些化学农药还高。
用苏云金芽孢杆菌防治茶树害虫,是解决农药污染茶叶的有效方法之一。陈涛和陈宗胜(1985)用苏云金芽孢杆菌对茶毛虫、茶尺蠖进行毒力测定,结果40-1菌剂对2~3龄茶毛虫幼虫的LC50值只为81.8µg/ml。田间防治油桐尺蠖,6天后的虫口减退率达88.6%~97.3%。
3.2 防治森林害虫中的应用
我国自50年代末从国外引进苏云金芽孢杆菌制剂后,首先用于林业防治松毛虫,取得了良好效果,积累了不少经验,在实践上解决了不少问题。我国许多地区用苏云金杆菌制剂防治后都观察到松毛虫再猖獗的周期延后了。山东省文登县连续四年用苏云金芽孢杆菌制剂防治赤松毛虫,其防治区比化防区松毛虫的发育情况(幼虫体长、蛹重、羽化率、产卵量、孵化率)明显要低,而松毛虫死亡率明显高于化防区。至1985年,国内已报道防治过的森林害虫,包括枯叶蛾、尺蠖、剌蛾、毒蛾、卷叶蛾、蓑蛾、灯蛾等19个科的56种害虫。
3.3 在蚊幼虫防治上的应用
80年代初和中期,我国有20多个省、市、自治区开展了应用苏云金芽孢杆菌以色列亚种灭蚊的研究和应用,其中广州、武汉、长春、北京、佛山等大中城市及一些农村城镇应用B.t.i.制剂,均有效地控制了当地主要蚊虫的的发生和为害。
3.4 影响菌效的因素
1. 菌剂的类别和质量 同一亚种的菌剂对不同种害虫的效果有异,不同亚种的菌剂对同一种害虫的效果也有差别,甚至同-亚种不同菌株所获菌剂的效果也不尽相同。-种菌剂可以对某一种害虫的防治效果很差,但可能对另一种害虫的防治效果很好。有时某一菌剂对某一害虫的效果本应很好,但由于菌剂生产过程中的问题(例如杂菌污染等)而质量很差,自然难以收到预期的效果。 当前菌剂标准化问题尚未很好解决,用稀释倍数和芽孢含量表示的浓度和用量,不是十分准确的,不同地区凭此比较效果或套用,也容易引起一些混乱。
2. 环境条件 如日光的照射对细菌病原的存活有很大影响,强烈日光下半小时,苏云金芽孢杆菌死亡约达50%。温度可影响病原和寄主的关系,寄主的最适温度范围往往也有利于发病。高温能加速昆虫的取食,而加速**的发展。如气温每天有数小时在15~20℃以上,就能收到较理想的效果,增加剂量可以部分地补偿低温的减效。在一定的温度下,高湿可诱发昆虫的细菌病。雨水有时能有利于细菌病原的扩散,而增强效果,但雨量过大过多则起冲刷作用,雨后须及时补施。
3. 使用技术 常须结合对防治对象生长发育特点和为害习性的掌握,采用正确的防治技术。例如使用菌剂的时间、场所、剂量、次数等,如能掌握得当,便能提高防治的效果。